拉姆化妆品联合实验室——数据化美丽：基于生化试验的化妆品功效验证

Ram Cosmetics Joint Laboratory - Digitized Beauty: Cosmetics Efficacy Verification Based on Biochemical Experiments

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生物化学试验法在功效宣称方面的应用有：

基于这一生化机制，可建立体外酪氨酸酶抑制活性评价方法：在特定pH（6.8）的磷酸盐缓冲体系中，酪氨酸酶催化底物多巴转化为多巴醌，该产物在475nm处呈现特征性光吸收。通过检测体系吸光度的变化，可定量评估受试物对酪氨酸酶活性的抑制效果。抑制率计算公式为：[（空白组吸光度-实验组吸光度）/空白组吸光度]×100%，该指标可客观反映受试物的美白功效潜力。

机体在外源（辐射、化学刺激等）和内源（有氧代谢）因素作用下，会产生高活性的含氧自由基及其衍生物（ROS），以及活性氮（RNS）。正常情况下，ROS参与免疫防御和细胞信号调控，但其过量累积会导致氧化应激，破坏细胞结构，加速皮肤老化。化妆品中抗氧化成分可通过清除或抑制自由基，延缓衰老。

常用抗氧化活性评价方法

DPPH法

DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）是一种稳定的紫色自由基（λmax=515-520 nm）。抗氧化剂可使其还原为黄色DPPH-H，吸光度降低，清除率与抗氧化能力成正比。

ABTS法

ABTS经氧化生成蓝绿色ABTS⁺•自由基（λmax=734 nm），抗氧化剂可使其褪色，吸光度下降反映自由基清除能力。

羟自由基（•OH）清除法

Fe²⁺/H₂O₂体系产生•OH，与水杨酸反应生成有色产物（λmax=510 nm）。抗氧化剂减少•OH，抑制显色，吸光度变化反映清除效果。

ORAC法

以AAPH作为自由基源，氧化荧光素使其荧光衰减。抗氧化剂延缓衰减，通过计算荧光衰减曲线下面积（AUC）量化抗氧化能力，结果以氧自由基吸收能力值（AOV）表示。

# 糖化抑制

生物体内，还原糖（如葡萄糖）可通过酶促反应与蛋白质、脂质或核酸结合，形成生理性糖基化修饰产物。同时，即使无酶参与，还原糖也能通过非酶糖基化反应（glycation）与生物大分子缓慢结合，最终形成晚期糖基化终末产物（AGEs）。AGEs的持续累积是衰老的重要特征，在皮肤中表现为暗沉发黄、弹性下降等现象。

为评估抗糖化功效，常采用体外BSA-葡萄糖（BSA-glc）反应体系模拟体内糖化过程。在该体系中，BSA与葡萄糖反应生成具有特征荧光的AGEs。通过检测特定波长下的荧光强度变化，可计算AGEs生成抑制率，从而定量评价受试物的抗糖化活性。

# 直接多肽反应性

过敏性接触性皮炎（ACD）是一种由外源物质引发的免疫介导性皮肤炎症反应（区别于刺激性接触性皮炎ICD）。其发病机制的关键起始步骤是外源物质穿透表皮后与皮肤蛋白共价结合形成半抗原，继而触发后续的免疫级联反应。

基于这一分子机制建立的直接多肽反应试验（DPRA），通过使用半胱氨酸和赖氨酸多肽模拟皮肤蛋白，与受试物在特定条件下反应后，采用HPLC定量分析多肽消耗率。该方法于2015年被OECD收录（Test Guideline 442C），并于2019年纳入我国《化妆品安全技术规范》。通过预先建立的判定标准，可有效评估受试物潜在的皮肤致敏风险。

# 透明质酸酶抑制

透明质酸（HA）作为细胞外基质的关键成分，在维持皮肤水合作用、弹性及创伤修复等生理过程中发挥核心功能，同时参与血管调节和过敏反应，与皮肤敏感性密切相关。透明质酸酶（HAase）是特异性降解HA的酶类，通过调控其活性可有效维持HA的生理功能。

基于HAase的酶解机制建立的功能评价方法：HAase水解HA生成β-N-乙酰葡糖胺，该产物在碱性条件下与乙酰丙酮缩合形成2-甲基-3-二乙酰吡咯衍生物，进而与对二甲氨基苯甲醛在酸性乙醇中反应生成530nm特征吸收产物。通过测定该波长下吸光度的变化，可定量评估受试物对HAase活性的抑制效果，并计算得到透明质酸酶抑制率，为相关功效评价提供客观依据。

# 基质金属蛋白酶抑制

基质金属蛋白酶（MMPs）是一类锌离子依赖的蛋白水解酶家族，在细胞外基质（ECM）的降解和重塑过程中起关键作用。其中，胶原酶类（MMP-1、-8、-13）、明胶酶类（MMP-2、-9）及弹性蛋白酶（MMP-12）等成员能够特异性降解皮肤中的胶原蛋白和弹性蛋白，直接影响皮肤的弹性和紧致度。因此，抑制MMPs活性可作为抗皱和皮肤年轻化功效的重要评价指标。

基于MMPs的酶学特性，可通过荧光或比色法进行活性检测：MMPs可特异性水解带有荧光或显色基团的底物，导致信号强度变化。当加入具有抑制活性的受试物时，底物水解速率降低，信号变化随之减缓，且抑制效果与信号变化程度呈剂量依赖性。通过比较处理组与对照组的信号差异，可准确计算MMPs抑制率，从而定量评价受试物的抗衰老功效潜力。

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生化实验

生化试验作为化妆品功效评价的重要手段，具有以下显著优势：

1）实验周期短，可快速获得初步结果；

2）操作简便，实验条件易于标准化控制；

3）成本相对较低，适合大规模筛选；

4）重复性好，数据可靠性高；

5）通量高，可同时进行多组平行实验。

然而需要指出的是，这类体外试验方法也存在一定局限性：

1）无法完全模拟人体复杂的生理环境；

2）缺乏皮肤屏障等关键生理结构的参与；

3）难以反映受试物的透皮吸收特性；

4）不能评估长期使用效果。

因此，在化妆品功效评价体系中，建议采用"体外生化试验+体外3D皮肤模型+人体功效评价"的多层次验证策略。具体而言：

- 初期可通过生化试验进行活性成分的快速筛选；

- 中期采用3D皮肤模型评估透皮性和细胞水平功效；

- 最终通过人体试验验证实际使用效果。

这种阶梯式的评价体系既能保证研发效率，又能确保功效宣称的科学性和可靠性，符合国内外化妆品监管要求。同时，建议结合消费者使用测试和长期跟踪观察，以全面评估产品的安全性和功效持续性。