范围

本方法规定了化妆品用化学原料光反应性活性氧（ROS）测定试验的基本要求和方法。

本方法适用于预测化妆品用化学原料的潜在光毒性。

实验目的

预测化妆品用化学原料是否具有潜在光毒性。

试剂和材料

除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为 GB/T6682规定的一级水。所有试剂应在配制后1个月内使用，并且在使用前应超声处理，以免物质析出、沉淀对试验造成影响。主要试剂配制方法如下：

3.1  磷酸二氢钠。

3.2  磷酸氢二钠。

3.3  N,N-二甲基-4-亚硝基苯胺（RNO）。

3.4  咪唑。

3.5  氯化硝基四氮唑蓝（NBT）。

3.6  pH 7.4的20 mmol/L磷酸钠缓冲液（NaPB）

3.7  0.2 mmol/L N,N-二甲基-4-亚硝基苯胺（RNO，CAS：138-89-6）

3.8  0.2 mmol/L咪唑（CAS：288-32-4）

3.9  0.4 mmol/L 氯化硝基四氮唑蓝（NBT，CAS：298-83-9）

3.10  溶剂的选择

3.11  待测化学物质溶液的配制

3.12  阴性对照及阳性对照

仪器和设备

4.1  太阳光模拟器

4.2  反应容器

4.3  酶标仪。

4.4  UVA紫外照度计。

4.5  显微镜。

分析步骤

5.1  将下列成分在避光条件下混合：

5.1.1  溶剂为DMSO的受试物：

以20 μL溶剂替代受试物，作为空白对照。涡旋或超声5~10 min后，将200 μL反应混合物加入到96孔板中，每组设置3个平行。96孔板加样详见附录D。

5.2  在100倍显微镜下检查反应混合物中各组分溶解情况。如有沉淀、析出等现象，需降低受试物浓度重新检测或停止检测。将96孔板震荡5 s后，使用分光光度计或酶标仪测定光照前SO检测孔在440 nm下的吸光度及SA检测孔在560 nm下的吸光度。

5.3  将96孔板置于石英反应器中，或盖上其他具有高UV透射率的盖子或密封件，置于太阳光模拟器中照射1 h。记录光照前后的温度。

5.4  完成光照后，将96孔板震荡1 min，使用分光光度计或酶标仪测定光照后SO检测孔在440 nm下的吸光度及SA检测孔在560 nm下的吸光度。

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